D-アミノ酸の分析方法 その1

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微生物から植物、ヒトを含む哺乳類まで、様々な組織に存在し、生理機能を有することも明らかとなってきたD-アミノ酸。これらの研究が発展してきた基盤には、D-アミノ酸を検出・分析する技術の進歩があります。

生体内のD-アミノ酸はL-アミノ酸などと比べて非常に微量であることが多く,またL-アミノ酸やペプチドなど多種多様な夾雑物の妨害を受けるため,その分析には高い感度と高い選択性、高い分離能が必要となります。分析の感度と選択性、分離能を高めるため、数多くの研究が進められてきました。

D-アミノ酸分析法は用いる機器や原理によって様々ありますが、測定するD-アミノ酸が遊離型か組織型(結合型)かによっても方法が異なってまいります。

本コラムでは下表のようにD-アミノ酸分析法を分類し、3回に分けてお伝えしてまいります。


分析方法
遊離型のD-アミノ酸 酵素法 D-アミノ酸酸化酵素を用いたD-アミノ酸全量測定
D-アスパラギン酸オキシダーゼを用いたD-Asp測定
アラニン脱水素酵素とアラニンラセマーゼを用いたD-Ala測定
D-セリンデヒドラターゼを用いたD-Ser測定
HPLC法 プレカラム誘導体化法(ジアステレオマー法)
キラルカラム法(光学分割カラム法)
LC/MS/MS法
二次元HPLC法
その他

ガスクロマトグラフィー (GC)、

高速キャピラリー電気泳動 (HPCE) など
結合型のD-アミノ酸 加水分解+HPLC分析
酵素分解+HPLC分析
その他 多次元赤外円二色性分光法 など

今回は遊離型のD-アミノ酸分析法のうち、酵素反応を用いた分析方法についてご紹介いたします。

① D-アミノ酸酸化酵素による全D-アミノ酸測定

D-アミノ酸酸化酵素(D-amino acid oxidase、以下DAO)は、様々なD-アミノ酸を酸化的に脱アミノ化し、ケト酸とアンモニアを生成する酵素です。DAOのほとんどはD-グルタミン酸(D-Glu)やD-アスパラギン酸(D-Asp)を除く、様々なD-アミノ酸を基質とします。L-アミノ酸には作用しないのでD-アミノ酸を検出する際に広く利用されますが、基質特異性が広いためD-アミノ酸を種類ごとに分別して定量することはできません。以前のコラム「D-アミノ酸関連酵素」でもお伝えいたしましたが、DAOをD-アミノ酸に作用させますと、下のように反応が進みます。この際に消費されるO2量や生成されるα-ケト酸量、H2O2量を測定することで、D-アミノ酸量を測定する方法が知られています。

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この原理を用いた測定キットは市販もされています。DAOにより生成されるH2O2と比色プローブまたは蛍光プローブとの間の反応を西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)が触媒し、比色または蛍光法により測定します。生体試料や食品中の遊離D-アミノ酸(D-Glu、D-Aspを除く)総量を測定することが可能です。

遊離型D-アミノ酸測定キットの測定原理イメージ図
図 遊離型D-アミノ酸測定キットの測定原理
(D-Amino Acid Assay Kit  Cell Biolabs. Inc.から引用)

DAOを用いたD-アミノ酸測定法ではD-Glu、D-Aspを除くD-アミノ酸全量が求められますが、個々のD-アミノ酸を分別して定量することはできません。個々のD-アミノ酸量を分別して定量するためには、ターゲットとするD-アミノ酸に特異的に働く酵素を用いる必要があります。

② D-アスパラギン酸オキシダーゼを用いたD-Asp測定

生体中に比較的高濃度に存在し、神経伝達、コラーゲン産生、生殖など様々な機能との関連が示唆されているD-Aspについては、これに特異的作用してDAOと同様に酸化的脱アミノするD-アスパラギン酸オキシダーゼが存在します。DAOの代りにD-アスパラギン酸オキシダーゼを使うことによってD-Aspを分別定量することが可能です。

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③ アラニン脱水素酵素とアラニンラセマーゼを用いたD-Ala測定

L体よりも強い甘味を呈し、食品の呈味性にも関与していると考えられているD-Alaについては、2つの酵素、アラニンラセマーゼ (AlaR)とL-アラニン脱水素酵素 (L-AlaDH)を用いて測定する方法が報告されています。

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この方法ではまずD-AlaはAlaRによってL-Alaに変換され、次にL-AlaDHによって脱アミノ化、脱水素されます。生じた水素をNADHと1-メトキシ-PMSを介して、テトラゾリウム塩が受容し、生成した水溶性ホルマザン量を吸光度測定することで間接的にD-Ala量を測定することが可能です。

④ D-セリンデヒドラターゼを用いたD-Ser測定法

弊社では、コスモ・バイオ株式会社様を通じて、D-Ser比色定量キットを提供しております。弊社の技術顧問でもある名古屋大学名誉教授、吉村徹教授らによって同定されたD-Serに特異的に作用する酵素Saccharomyces cerevisiae由来のD-セリンデヒドラターゼ(D-Serine dehydratase、DsdSC)と、乳酸脱水素酵素(Lactate dehydrogenase、LDH)を使用して、尿サンプル等を対象に比色法にて簡便にD-Serを定量することができます。

この測定原理ではまず、D-SerはDsdSCによってピルビン酸に転換されます。産生されたピルビン酸をLDHによって乳酸へと変換し、その反応に際してNADHが酸化されてNADに変化します。NADHの減少を波長340nmにおける吸光度の低下を測定し、検量線からD-Ser濃度を求めることができます。

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図 D-セリン測定キットの測定原理
(D-セリン測定キット(比色法) コスモ・バイオ株式会社から、弊社加工)

なおD-セリンデヒドラターゼを用いてD-Serをピルビン酸とした後、ピルビン酸オキシダーゼによってこれを酸化し、その際生成するH2O2を上記D-アミノ酸測定キットのようにHRPと比色・蛍光プローブを用いて定量することも可能です。

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今回はD-アミノ酸の分析方法のうち、遊離型のD-アミノ酸を酵素法で測定する手法についてご紹介いたしました。いずれの方法も、酵素がD-アミノ酸を基質として特異的に反応することによってD-アミノ酸を検出することが可能となっています。従って、酵素の基質特異性の高さ、反応性の高さが重要となっています。

次回は遊離型のD-アミノ酸を主に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定、分析する方法についてお伝えいたします。

参考・引用文献

  1. 真鍋久:日本食生活学会誌, 5, 25-41 (1994)
  2. 遊離D-アミノ酸測定キット:フナコシ株式会社 (https://www.funakoshi.co.jp/contents/70508)
  3. 松本菜月, 金内誠:日本醸造協会誌, 116, 573-583 (2021).
  4. Ashida H, Sawa Y, Yoshimura T: Biosci. Biotechnol. Biochem., 85, 2221-2223 (2021).
  5. Munetaka Ishiyama, Kazumi Sasamoto, Masanobu Shiga, Yosuke Ohkura, Keiyu Ueno, Katsuhiko Nishiyama, Isao Taniguchi: Analyst, 120, 113-116 (1995).
  6. D-セリン測定キット:コスモ・バイオ株式会社
    (https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/csr-20130517-1.asp?entry_id=11050)
  7. Tomokazu Ito, Kei Takahashi, Tomoko Naka, Hisashi Hemmi, Tohru Yoshimura: Anal. Biochem., 371, 167-172 (2007).
  8. Tomokazu Ito, Hisashi Hemmi, Kunishige Kataoka, Yukio Mukai, Tohru Yoshimura: Biochem. J., 409, 399-406 (2008).

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