D-アミノ酸の分析方法 その１
微生物から植物、ヒトを含む哺乳類まで、様々な組織に存在し、生理機能を有することも明らかとなってきたD-アミノ酸。これらの研究が発展してきた基盤には、D-アミノ酸を検出・分析する技術の進歩があります。
生体内のD-アミノ酸はL-アミノ酸などと比べて非常に微量であることが多く，またL-アミノ酸やペプチドなど多種多様な夾雑物の妨害を受けるため，その分析には高い感度と高い選択性、高い分離能が必要となります。分析の感度と選択性、分離能を高めるため、数多くの研究が進められてきました。
D-アミノ酸分析法は用いる機器や原理によって様々ありますが、測定するD-アミノ酸が遊離型か組織型（結合型）かによっても方法が異なってまいります。
本コラムでは下表のようにD-アミノ酸分析法を分類し、３回に分けてお伝えしてまいります。
| 分析方法 | ||
|---|---|---|
| 遊離型のD-アミノ酸 | 酵素法 | D-アミノ酸酸化酵素を用いたD-アミノ酸全量測定 |
| D-アスパラギン酸オキシダーゼを用いたD-Asp測定 | ||
| アラニン脱水素酵素とアラニンラセマーゼを用いたD-Ala測定 | ||
| D-セリンデヒドラターゼを用いたD-Ser測定 | ||
| HPLC法 | プレカラム誘導体化法（ジアステレオマー法） | |
| キラルカラム法（光学分割カラム法） | ||
| LC/MS/MS法 | ||
| 二次元HPLC法 | ||
| その他 |
ガスクロマトグラフィー (GC)、 高速キャピラリー電気泳動 (HPCE) など |
|
| 結合型のD-アミノ酸 | 加水分解+HPLC分析 | |
| 酵素分解+HPLC分析 | ||
| その他 | 多次元赤外円二色性分光法 など | |
今回は遊離型のD-アミノ酸分析法のうち、酵素反応を用いた分析方法についてご紹介いたします。
① D-アミノ酸酸化酵素による全D-アミノ酸測定
D-アミノ酸酸化酵素（D-amino acid oxidase、以下DAO）は、様々なD-アミノ酸を酸化的に脱アミノ化し、ケト酸とアンモニアを生成する酵素です。DAOのほとんどはD-グルタミン酸(D-Glu)やD-アスパラギン酸（D-Asp）を除く、様々なD-アミノ酸を基質とします。L-アミノ酸には作用しないのでD-アミノ酸を検出する際に広く利用されますが、基質特異性が広いためD-アミノ酸を種類ごとに分別して定量することはできません。以前のコラム「D-アミノ酸関連酵素」でもお伝えいたしましたが、DAOをD-アミノ酸に作用させますと、下のように反応が進みます。この際に消費されるO2量や生成されるα-ケト酸量、H2O2量を測定することで、D-アミノ酸量を測定する方法が知られています。
この原理を用いた測定キットは市販もされています。DAOにより生成されるH2O2と比色プローブまたは蛍光プローブとの間の反応を西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）が触媒し、比色または蛍光法により測定します。生体試料や食品中の遊離D-アミノ酸（D-Glu、D-Aspを除く）総量を測定することが可能です。
（D-Amino Acid Assay Kit Cell Biolabs. Inc.から引用）
DAOを用いたD-アミノ酸測定法ではD-Glu、D-Aspを除くD-アミノ酸全量が求められますが、個々のD-アミノ酸を分別して定量することはできません。個々のD-アミノ酸量を分別して定量するためには、ターゲットとするD-アミノ酸に特異的に働く酵素を用いる必要があります。
② D-アスパラギン酸オキシダーゼを用いたD-Asp測定
生体中に比較的高濃度に存在し、神経伝達、コラーゲン産生、生殖など様々な機能との関連が示唆されているD-Aspについては、これに特異的作用してDAOと同様に酸化的脱アミノするD-アスパラギン酸オキシダーゼが存在します。DAOの代りにD-アスパラギン酸オキシダーゼを使うことによってD-Aspを分別定量することが可能です。
③ アラニン脱水素酵素とアラニンラセマーゼを用いたD-Ala測定
L体よりも強い甘味を呈し、食品の呈味性にも関与していると考えられているD-Alaについては、２つの酵素、アラニンラセマーゼ (AlaR)とL-アラニン脱水素酵素 (L-AlaDH)を用いて測定する方法が報告されています。
この方法ではまずD-AlaはAlaRによってL-Alaに変換され、次にL-AlaDHによって脱アミノ化、脱水素されます。生じた水素をNADHと1-メトキシ-PMSを介して、テトラゾリウム塩が受容し、生成した水溶性ホルマザン量を吸光度測定することで間接的にD-Ala量を測定することが可能です。
④ D-セリンデヒドラターゼを用いたD-Ser測定法
弊社では、コスモ・バイオ株式会社様を通じて、D-Ser比色定量キットを提供しております。弊社の技術顧問でもある名古屋大学名誉教授、吉村徹教授らによって同定されたD-Serに特異的に作用する酵素Saccharomyces cerevisiae由来のD-セリンデヒドラターゼ（D-Serine dehydratase、DsdSC）と、乳酸脱水素酵素（Lactate dehydrogenase、LDH)を使用して、尿サンプル等を対象に比色法にて簡便にD-Serを定量することができます。
この測定原理ではまず、D-SerはDsdSCによってピルビン酸に転換されます。産生されたピルビン酸をLDHによって乳酸へと変換し、その反応に際してNADHが酸化されてNAD＋に変化します。NADHの減少を波長340nmにおける吸光度の低下を測定し、検量線からD-Ser濃度を求めることができます。
（D-セリン測定キット（比色法） コスモ・バイオ株式会社から、弊社加工）
なおD-セリンデヒドラターゼを用いてD-Serをピルビン酸とした後、ピルビン酸オキシダーゼによってこれを酸化し、その際生成するH2O2を上記D-アミノ酸測定キットのようにHRPと比色・蛍光プローブを用いて定量することも可能です。
今回はD-アミノ酸の分析方法のうち、遊離型のD-アミノ酸を酵素法で測定する手法についてご紹介いたしました。いずれの方法も、酵素がD-アミノ酸を基質として特異的に反応することによってD-アミノ酸を検出することが可能となっています。従って、酵素の基質特異性の高さ、反応性の高さが重要となっています。
次回は遊離型のD-アミノ酸を主に高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて測定、分析する方法についてお伝えいたします。
参考・引用文献
- 真鍋久：日本食生活学会誌, 5, 25-41 (1994)
- 遊離D-アミノ酸測定キット：フナコシ株式会社 (https://www.funakoshi.co.jp/contents/70508)
- 松本菜月, 金内誠：日本醸造協会誌, 116, 573-583 (2021).
- Ashida H, Sawa Y, Yoshimura T: Biosci. Biotechnol. Biochem., 85, 2221-2223 (2021).
- Munetaka Ishiyama, Kazumi Sasamoto, Masanobu Shiga, Yosuke Ohkura, Keiyu Ueno, Katsuhiko Nishiyama, Isao Taniguchi: Analyst, 120, 113-116 (1995).
- D-セリン測定キット：コスモ・バイオ株式会社
(https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/csr-20130517-1.asp?entry_id=11050) - Tomokazu Ito, Kei Takahashi, Tomoko Naka, Hisashi Hemmi, Tohru Yoshimura: Anal. Biochem., 371, 167-172 (2007).
- Tomokazu Ito, Hisashi Hemmi, Kunishige Kataoka, Yukio Mukai, Tohru Yoshimura: Biochem. J., 409, 399-406 (2008).
